產(chǎn)品描述一、 化學(xué)結(jié)構(gòu)：二、 檢測原理：本產(chǎn)品是一種新型的對 Lipid ROS 高選擇性、高靈敏的脂質(zhì)過氧化傳感器，與其他 ROS 捕獲探針不同之處在于，具有好的親脂性可以快速入膜，隨后可以選擇性的對細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞膜中的脂質(zhì)過氧化(Lipid ROS)進(jìn)行捕獲，并在氧化后仍保持親脂性，不會離開脂質(zhì)膜，該過程同時伴隨熒光信號變化。多用于熒光顯微鏡、流式細(xì)胞分析等對 Lipid ROS 的可視化監(jiān)測。本產(chǎn)品 結(jié)構(gòu)中多不飽和丁間二烯基在 Lipid ROS 催化氧化后，其熒光發(fā)射峰從 590 nm偏移至 510 nm。實(shí)驗(yàn)步驟

1. 樣品溶解：

商品開封后，離心機(jī)輕甩；隨后加入適量 DMSO 進(jìn)行溶解，溶解度至少可達(dá) 25mg/mL。溶解后建議分裝-20℃避光保存，盡量避免反復(fù)凍融，防止吸潮。

【注】：樣品輕甩目的是為了避免痕量的探針吸附管壁損失樣本。

2. 樣品使用：

1) 流式細(xì)胞分析：

懸浮細(xì)胞：800 g 離心 5 min 收集細(xì)胞沉淀；隨后 PBS 洗滌細(xì)胞兩遍。

貼壁細(xì)胞：棄培養(yǎng)液，用常溫 PBS 或培養(yǎng)液輕洗細(xì)胞 2 次，隨后胰酶消化，800g 離心 5 min 收集細(xì)胞沉淀，隨后 PBS 洗滌細(xì)胞兩遍，每個樣本收集 1~5 ×105 個細(xì)胞。(注意：操作過程中輕柔吹打細(xì)胞， 消化時間不宜過長，劇烈吹打或胰酶消化過度會影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果)

本產(chǎn)品 用于脂質(zhì)過氧化檢測的推薦濃度為終濃度 5μM；配制方法：用新鮮空白培養(yǎng)液配制終濃度為 5μM 的本產(chǎn)品染色液待用，DMSO 含量≤5‰。

(注意：該步操作建議在消化細(xì)胞前準(zhǔn)備好，以免細(xì)胞消化后久置影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果)

將事先配置好的脂質(zhì)過氧化染色液加入收集的細(xì)胞沉淀中，推薦體積為 500μL，隨后置于 37℃孵箱， 染色 30min，期間 5-10min 間隔輕彈細(xì)胞使其懸浮保證染色更充分。

染色結(jié)束后，800 g 離心 5 min，棄上清，隨后用PBS 清洗細(xì)胞 2 次，加入 200μLPBS 重懸細(xì)胞用于流式分析。

2） 原位成像：

接種適當(dāng)密度的細(xì)胞于 20mm 規(guī)格的蓋玻片上（也可用共聚焦小皿替代），給予實(shí)驗(yàn)藥物處理適當(dāng)時間后，吸去培養(yǎng)液，用 PBS 洗滌細(xì)胞一遍加入 500 μL 配制好的脂質(zhì)過氧化染色液，于 37℃染色 30min；（配制方法參考流式分析中的染色液配制）棄培養(yǎng)液，PBS 洗滌細(xì)胞兩遍后熒光顯微鏡或激光共聚焦下進(jìn)行成像檢測。細(xì)胞在染色后應(yīng)在 1 h 之內(nèi)完成檢測。

3）檢測條件：該分子探針在還原狀態(tài)下最佳激發(fā)波長為 581 nm, 發(fā)射為 591nm；被 Lipid ROS 氧化后最佳激發(fā)波長為 500 nm，發(fā)射在 510nm。因此，在流式分析中檢測通道為 FL1-A；激光共聚焦檢測：氧化態(tài)激發(fā)波長可選488nmFITC）通道；還原態(tài)激發(fā)波長可選 561 nm（TRITC）通道。

實(shí)驗(yàn)案例分析流式分析實(shí)驗(yàn)范例：使用本試劑檢測 10 μM RSL3（鐵死亡經(jīng)典誘導(dǎo)劑）處理 A549 細(xì)胞 24 h 后的細(xì)胞脂質(zhì)過氧化水平的流式檢測

原位成像實(shí)驗(yàn)范例：

下圖為 RSL3（10 μM）處理A549 細(xì)胞 24 h 后，使用本試劑（5μM）對活細(xì)胞中脂質(zhì)過氧化水平進(jìn)行原位染色后激光共聚焦成像結(jié)果。